発酵のメカニズム図鑑

ゲノム編集技術による発酵微生物の機能改変：CRISPR/Casシステムの応用と代謝経路最適化

導入：発酵産業におけるゲノム編集技術の革新

発酵プロセスは、微生物の代謝能力を利用して特定の有用物質を生産する、歴史と実績のある技術です。食品生産から医薬品、バイオ燃料、ファインケミカルまで多岐にわたる分野で応用されています。近年、遺伝子工学の飛躍的な進歩、特にゲノム編集技術の登場は、発酵微生物の機能改変に新たな可能性をもたらしました。従来の育種や変異導入では実現困難であった、特定の遺伝子の精密な操作が可能になったことで、目的生産物の収率向上、新規物質生産、副産物の抑制など、発酵プロセスの抜本的な改善が期待されています。

本稿では、数あるゲノム編集技術の中でも、特に発酵微生物の分野で強力なツールとなっているCRISPR/Cas（クリスパー/キャス）システムの原理とその応用、代謝経路の精密制御による機能最適化のメカニズム、そして最新の研究動向について解説します。

CRISPR/Casシステムの原理と発酵微生物への適用

CRISPR/Casシステムは、細菌やアーキアが持つ獲得免疫システムに由来する、標的DNAを特異的に切断するメカニズムです。このシステムは、ガイドRNA（gRNA）とCasヌクレアーゼ（最も一般的なのはCas9）の複合体によって機能します。gRNAは標的DNA配列と相補的に結合し、Casヌクレアーゼをその部位に誘導し、二本鎖切断（DSB）を引き起こします。このDSBは、細胞内のDNA修復機構（非相同末端結合：NHEJ、または相同組換え：HDR）によって修復されます。

• 非相同末端結合（NHEJ）: 切断されたDNA末端を直接再結合する修復経路です。エラーが導入されやすく、挿入・欠失（indel）変異を引き起こすことで遺伝子をノックアウト（機能破壊）するために利用されます。
• 相同組換え（HDR）: 相同性を持つDNAテンプレートが存在する場合に、そのテンプレートを鋳型として正確にDNAを修復する経路です。これにより、特定の遺伝子をノックイン（導入）したり、既存の遺伝子配列を精密に改変したりすることが可能になります。

（このCRISPR/Casシステムの作用メカニズムは図で示すとより分かりやすいでしょう。）

発酵微生物へのCRISPR/Casシステムの適用は、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌など、多種多様な微生物で成功しています。しかし、微生物の種類によっては、プラスミドの導入効率、Cas9タンパク質の発現、gRNAの安定性、そして特にHDR効率の低さが課題となることがあります。近年の研究では、これらの課題を克服するため、最適化されたCas9バリアントの開発、効率的なゲノムデリバリー方法（例：エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換）、そしてHDR効率を高めるためのリコンビナーゼの共発現などが試みられています。

代謝経路の精密制御と最適化

ゲノム編集技術の最大の利点は、発酵微生物の代謝経路を分子レベルで自在に設計・再構築できる点にあります。目的生産物の収率を最大化するためには、以下の戦略が一般的に用いられます。

1. 目的生産物合成経路の増強: 目的生産物の合成に関わる律速段階の酵素遺伝子を過剰発現させたり、酵素活性の高い変異体を導入したりすることで、経路全体の flujo（流束）を向上させます。例えば、特定の有機酸生産において、経路内の初期段階の酵素を強化することで、中間代謝物のプールを拡大し、最終生産物への変換効率を高めることができます。近年のデータによると、CRISPRi（CRISPR干渉）やCRISPRa（CRISPR活性化）といった遺伝子発現制御ツールを併用することで、特定の遺伝子の発現量をきめ細かく調節し、代謝経路のバランスを最適化する研究も進んでいます。

2. 副産物生成経路の抑制: 目的生産物とは異なる代謝産物へ炭素源が流れる経路を遮断することで、目的生産物への分配を最大化します。これは、副産物合成に関わる遺伝子をノックアウトするか、その発現を抑制することで達成されます。例えば、酵母におけるエタノール生産において、グリセロールや酢酸といった副産物の生成に関わる遺伝子を削除することで、エタノール収率が向上することが複数の研究で示されています。

3. 異種遺伝子の導入と新規経路の構築: 自然界に存在しない代謝経路を微生物に付与することで、全く新しい有用物質を生産する「合成生物学」のアプローチです。ゲノム編集を用いることで、複数の異種遺伝子をゲノム上の特定の位置に精密に組み込むことが可能になり、複雑な生合成経路を構築できるようになりました。これにより、従来の化学合成では困難であった、高付加価値な天然物や生体触媒の生産が実現されつつあります。

（これらの代謝経路の変更は、模式的な図で示すと理解が深まるでしょう。）

最新の研究事例と今後の展望

ゲノム編集技術を用いた発酵微生物の機能改変は、以下のような多岐にわたる応用例があります。

• バイオ燃料生産: 酵母や微細藻類におけるエタノールやブタノール、イソブタノールなどの生産効率向上。特に、非食料系バイオマスからの糖化・発酵を可能にするためのセルロース分解酵素遺伝子の導入や、耐性強化に関する研究が進められています。
• アミノ酸・有機酸生産: 大腸菌や枯草菌を用いたL-リジン、L-グルタミン酸、コハク酸などの高効率生産。代謝経路内の複数の律速段階を同時に改変することで、従来の株に比べて大幅な生産性向上が報告されています。
• 高機能性素材・医薬品原料生産: 天然物由来の二次代謝産物、高分子材料モノマー、組換えタンパク質医薬品などの微生物生産。複雑な生合成経路の遺伝子クラスターをゲノムに導入・最適化する研究が進んでいます。

今後の展望としては、CRISPR/Casシステムのさらなる高効率化と汎用化が挙げられます。例えば、より小型で多様なCasヌクレアーゼの発見や、一本鎖切断のみを行うCas9ニッカーゼやCas12a（Cpf1）といった異なるタイプのCas酵素の利用が、オフターゲット効果の低減や複数の遺伝子を同時に編集するマルチプレックス編集の効率化に貢献しています。また、in situでのゲノム編集技術の開発は、大規模培養環境下での微生物の特性改変を可能にし、工業スケールでの応用を加速させるでしょう。

しかし、ゲノム編集微生物の安全性評価や法規制の整備、そして編集効率のさらなる向上、特に非モデル微生物への適用拡大は引き続き重要な課題です。これらの課題を克服し、ゲノム編集技術が発酵産業の持続可能な発展に貢献する可能性は非常に大きいと考えられます。

結論

ゲノム編集技術、特にCRISPR/Casシステムは、発酵微生物の機能改変における精密性と効率性を飛躍的に向上させました。これにより、これまで経験的な育種に頼ってきた微生物株改良が、分子レベルでの論理的な設計に基づき実行可能になっています。代謝経路の最適化、新規物質の生産、そして発酵プロセスの抜本的な改善は、食料、エネルギー、医療、素材といった多岐にわたる分野で革新的なソリューションを提供するでしょう。

この技術は、微生物学、代謝工学、合成生物学といった複数の学術領域の知見を融合することで、さらなる進化を遂げる可能性があります。今後の研究では、より複雑な微生物システムにおける多遺伝子編集の効率化、オフターゲット効果の厳密な評価、そして微生物ゲノムの「設計図」を完全に理解し、望む機能を持つ微生物をゼロから構築する合成生物学の究極の目標に向けた取り組みが加速すると予想されます。